冠心病Coronaryarterydisease(CAD)是冠状动脉性心脏病的简称，是一种常见的心脏疾病。近年来，研究者们采用代谢组学方法发现了众多与CAD相关的生物标志物。但这些生物标志物的分子机制仍缺乏合理的解释。功能代谢组学即通过代谢组学手段发现差异代谢物，并采用分子生物学技术深入研究差异代谢物与疾病相关的分子机制的系统生物学方法。其可以构建差异代谢物与疾病发病机制之间的关系，对于差异代谢物及其生成酶的深入研究有利于临床治疗靶标的发现及新治疗思路的开发。

今天为大家介绍一篇基于代谢组学手段，揭示CAD差异代谢物N-乙酰神经氨酸作用的文献，作者在4个临床中心进行了共例CAD的组群研究，采用LC-Q-TOF/MS方法在患者血浆样本中鉴定了36种差异代谢物。并选择与CAD疾病进程具有高相关性的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)进行验证。采用功能代谢组学手段对Neu5Ac及其生成酶神经胺酸苷酶（Neuraminidase-1）在CAD疾病进程中的分子机制进行研究。

该研究从差异代谢物发现到机制探索，从体外细胞水平到体内动物模型研究，从基础研究到临床应用解释了以下关键问题：Neu5Ac浓度的升高是否会导致心肌损伤，具体的分子机制如何？敲除Neuraminidase-1是否对心肌损伤产生修复作用？Neuraminidase-1的抑制剂奥司他韦(OS)及扎那米韦(ZA)是否可以对心肌损伤起到保护作用?

图1冠状动脉正常组(NCA)及不同CAD类型：冠状动脉粥样硬化(NOCA)、稳定型心绞痛(SA)、不稳定型心绞痛(UA)、急性心肌梗塞(AMI)的交叉对比研究

如图1A所示，基于非靶向代谢组学手段。共有15种氨基酸、12种游离脂肪酸、8种有机酸和1种神经氨酸被鉴定为差异代谢物。除Neu5Ac外，大多数代谢产物归属于能量代谢通路。在4个不同的临床中心，Neu5Ac均与CAD的疾病进程具有显著的相关性（图1B），作者通过建立靶向LC-MS/MS方法，对Neu5Ac进行准确定量分析。其在NCA、NOCA、SA、UA、AMI组中的含量分别为.20,.43,.70,.25,.34ng/mL（图1C），与代谢组学研究结果一致。

图2Neu5Ac触发心肌损伤研究

接下来，作者验证了Neu5Ac是否具有心肌损伤的作用。采用Neu5Ac处理心室肌细胞（NRVMs）后，NRVMs的细胞活力显著降低（图2A），两种与心肌损伤相关的心肌酶LDH(乳酸脱氢酶)和CK-MB(肌酸激酶-同工酶)的浓度显著升高，并与Neu5Ac呈剂量依赖（图2B）。Tunel染色实验结果显示，Neu5Ac诱导NRVMs细胞的凋亡（图2C）。在进一步的体内实验中，如图2D所示，大鼠腹腔注射Neu5Ac6周后，LVEDP(左心室舒张末压)、LV-dP/dtmax(左心室内压最大上升速率)及LVdP/dtmax(左心室内压最大下降速率)显著上升，说明大鼠的心室收缩及舒张功能受到影响，Neu5Ac具有显著的心肌损伤作用。

图3Neu5Ac诱导的心肌细胞损伤与ROCK信号通路及Rho蛋白家族的关联研究

为了阐明Neu5Ac诱导NRVMs损伤的分子机制，作者验证了Neu5Ac与Rho、Rho相关蛋白激酶通路(ROCK)的关联。如图3A-C，分子对接结果显示，Neu5Ac与Rho家族中的主要成员RhoA和Cdc42蛋白可以合理匹配。等离子共振结果同样显示Neu5Ac与RhoA和Cdc42蛋白具有高结合亲和力。同时，Neu5Ac显著上调了RhoA和Cdc42蛋白的表达量（图3D）。在NRVMs中，Neu5Ac与RhoA及Cdc42特异性结合并可通过激活ROCK信号通路上调二者表达。为验证Neu5Ac导致的心肌损伤是否与RhoA及Cdc42相关，作者采用RhoA蛋白的抑制剂CCG-预处理NRVMs。CCG-显著减弱了Neu5Ac诱导的心肌损伤作用，并降低了LDH及CK-MB的生成（图3E）。同样的，采用siRNA沉默RhoA和Cdc42蛋白的表达后，Neu5Ac诱导的心肌损伤作用显著改善（图3G-H）。结果表明，ROCK通路中的Rho蛋白家族成员RhoA和Cdc42蛋白是导致Neu5Ac诱导的心肌损伤的主要分子机制。

图4Neuraminidase-1敲除与心肌细胞缺血损伤的保护作用研究

神经氨酸苷酶neuraminidase-1是调节Neu5Ac生成的主要酶，采用慢病毒敲除neuraminidase-1，Neu5Ac显著下调。为明确Neuraminidase-1的器官特异性特征，建立左心室特异性敲除Neuraminidase-1的大鼠体内模型，并在敲除后采用异丙肾上腺素及结扎法分别诱导心肌缺血。Neuraminidase-1敲除(KD)组中，Neuraminidase-1及尿液中Neu5Ac含量显著降低（图4A-B），Neuraminidase-1敲除(KD)组对异丙肾上腺素诱导的急性心肌缺血具有抵抗作用，主要体现在炎症细胞数量降低以及相关心脏功能指标的提升（图4C-D）。在结扎诱导的心肌缺血模型中，Neuraminidase-1敲除(KD)组显示出同样的抵抗趋势（图4E-F）。结果表明Neuraminidase-1可以作为保护心肌的潜在靶点。

图5NRVMs中奥司他韦和扎那米韦的心肌保护作用研究

基于此，作者选择了Neuraminidase-1的化学抑制剂奥司他韦(OS)和扎那米韦(ZA)，两种上市已久的抗流感一线用药，采用糖氧剥夺(OGD)模型NRVMs研究其保护作用。如图5A-C所示，OS及ZA显著降低Neu5Ac浓度，提高细胞生存率并抑制细胞凋亡。同时，OS及ZA抑制Neuraminidase-1,RhoA,Cdc42的表达。并使ROCK通路下游的JNK及ERK靶点去磷酸化灭活，从而抑制ROCK效应因子ROCK1和ROCK2的表达（图5C-D）。

图6大鼠中奥司他韦和扎那米韦的心肌保护作用研究

作者进一步在大鼠体内分析OS及ZA的心脏保护作用。如图6A-B所示，OS及ZA通过抑制Neuraminidase-1降低尿液中Neu5Ac含量。HE染色图及心脏功能指标分析结果可见，OS及ZA对于异丙肾上腺素诱导的心肌缺血具有保护作用并抑制ROCK及细胞凋亡相关信号通路（图6C-E）。OS及ZA显著降低了心肌梗死面积，并通过抑制Neuraminidase-1保护心肌，主要体现在增强心脏功能指标及延长模型大鼠生存率两方面（图F-I）。因此，OS及ZA具有潜在的心肌保护作用。

该研究采用功能代谢组学的研究思路和手段在寻找差异代谢物的同时，深入研究了其与疾病相关的分子机制，主要结果总结：1.发现并鉴定了36种CAD疾病进程中的差异代谢物，包括文章主要研究对象Neu5Ac；2.Neu5Ac与CAD疾病进程密切相关，作为信号分子，可通过Rho/ROCK-JNK/ERK信号通路触发RhoA和Cdc42蛋白介导的心肌损伤过程；3.对于生成Neu5Ac的主要酶Neuraminidase-1进行敲除或沉默处理，OGD诱导的心肌细胞损伤及异丙肾上腺素及结扎诱导的心肌缺血模型大鼠的相应指标得到显著改善；4.发现了抗流感药物OS及ZA的心肌保护新作用。

最终作者阐述了该研究结果的潜在临床应用价值：1.Neu5Ac可以作为反映CAD疾病进程的生物标志物；2.Neu5Ac及Neuraminidase-1可以作为临床上改善心肌缺血的新靶点进行研究及新药开发；3.抗流感药物OS及ZA可以被用于CAD的治疗方案中。

参考文献：

ZhangL,WeiT,LiY,etal.FunctionalMetabolomicsCharacterizesaKeyRoleforN-Acetyl-NeuraminicAcidinCoronaryArteryDiseases.Circulation.OriginallypublishedDecember6,.

文献整理人：唐煜；编辑：生宁张金兰；第79期